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L'analisi della
Frazione Insaponificabile
Dott. Francesco Meriani

• preparazione frazione insaponificabile
  10g di sostanza da analizzare vengono posti in una beuta con 100ml di KOH 2N in EtOH e portati ad ebollizione per un ora.
  Successivamente si raffredda fino a 30-35 ºC, si lava con acqua distillata ed etere etilico e si immette in un imbuto separatore.
  Si agita e poi si lascia riposare.
  Dopo separazione sulla fase acquosa si effettuano due ulteriori estrazioni con 50ml di etere etilico; si riuniscono gli estratti in un imbuto separatore e si lavano con 50 ml di acqua per due o tre volte.
• purificazione frazione insaponificabile con cromatografia su colonna
  Dopo essicamento tramite Na₂SO₄ anidro si distilla l'etere fino ad ottenere un volume non superiore a 4 ml.
  Si prepara nel frattempo una colonna cromatografica impaccandola con una sospensione uniforme di allumina (10g) ed etere etilico (50ml).
  Successivamente si versano nella colonna la soluzione di etere contenente la frazione insaponificabile, e si lava il contenitore con qualche ml di etere etilico.
  Lavando la colonna con 200 ml di etere etilico otteniamo la frazione insaponificabile, mentre eventuali acidi grassi liberi rimangono adsorbiti nella colonna.
  Per distillazione (sotto vuoto per gli ultimi ml) si elimina l'etere.
• Separazione dei costituenti tramite cromatografia su strato sottile (TLC)
  Una lastra di vetro di 20x20 cm viene ricoperta da una sospensione omogenea di 40 g di silice in 80 g di acqua, alta 0.25 mm.
  Dopo che la lastra è asciutta (all'aria per un'ora ed in stufa a 120 ºC per due ore) la si può conservare in un apposito essicatore.
  Nel frattempo si prepara una soluzione al 5% della frazione insaponificabile in cloroformio.
  0.3 ml di codesta soluzione vengono strisciati con una microsiringa a 2 cm dal bordo della lastra cromatografica (linea di partenza).
  La corsa si ottiene in solvente esano : etere = 1: 1 fino a 1 cm dal bordo superiore della lastra.
  Una volta che l'analisi TLC si è completata si asciuga la lastra e la si bagna conl sale sodico di 2,7-diClfluorescina O.1% in EtOH (fluorescente nel giallo).
  Si otterrà una cromatografia di questo tipo:
  • fronte + carotenoidi
  • idrocarburi
  • tocoferoli
  • alcooli superiori e triterpenici
  • steroli
  • eritrodiolo e uvaolo
  • start
• asportazione della banda degli steroli e loro silanizzazione (=> TMSE)
  La banda degli steroli viene asportata con una spatola e viene aggiunta di 25ml di etere etilico.
  Dopo qualche ora di riposo si filtra e a b.m. a 60 ºC si evapora cautamente.
  Infine si seccano gli steroli in stufa a 100 ºC per 10 min.
  Poichè gli steroli non sono adatti ad essere sottoposti direttamente ad una analisi cromatografica, è più opportuno trasformarli nei loro trimetilsilileteri (TMSE) facendoli reagire con 0.2 ml di metilformammide, 0.2 ml di esametildisilazano e 0.2 ml di trimetilclorosilano (a temperatura ambiente per mezz'ora).
• gas-cromatografia dei TMSE
  L'apparecchio usato è un gas-cromatografo ad alta risoluzione con fase fissa costituita da polimetilfenilsilossano (OV17) al 3% su supporto inerte di Chromosorb W 80-100 mesh, largo internamente 3.5 mm circa e lungo da 2 a 3 metri. Non esiste, data la variabilità delle colonne, un protocollo standard (per esempio si può operare con una camera d'iniezione a 280 ºC e con una colonna a 240 ºC).
• identificazione e valutazione del contenuto dei vari steroli.
  L'analisi di un olio di oliva genuino deve dare i seguenti valor di steroli:
  • beta-sitosterolo + delta5-avenasterolo 3 94 %
  • campesterolo 3 2.5 % * 4 %
  • stigmasterolo 3 1 % * 2.5 %
  • delta7-stigmasterolo * 1 %
  • colesterolo = 0 % tracce
  NB: nell'olio di sansa la percentuale riferita a beta-sitosterolo + delta5-avenasterolo dev'essere 3 93% (con colonne a maggiore potere risolutivo si può notare che lo sterolo delta5-avenasterolo rappresenta circa il 14% degli steroli totali).

• Metodo Ufficiale - o metodo dell'eritrodiolo, è utile per rilevare la sofisticazione con olio di sansa modificato.
  L'eritrodiolo e l'uvaolo sono presenti in quantità notevole negli olî di sansa, anche in quelli decerati; nell'olio di oliva vergine o rettificato invece sono presenti in piccola percentuale.
  L'analisi procede in modo identico alla precedente, solo che dalla lastra TLC asciugata si asporta non solo la linea degli steroli ma anche di quella sottostante dell'eritrodiolo e dell'uvaolo.
  La silanizzazione procede in modo indentico.
  Dopo aver ottenuto i picchi dall'analisi cromatografica la percentuale di eritrodiolo e di uvaolo si ottiene dalla espressione sottostante:
  
  c % = 100 (E1 + E2)/ E1 + E2 + ES
  
  E1 = area in mm² del picco dell'eritrodiolo
  E2 = area in mm² del picco dell'uvaolo
  ES = area in mm² dei vari picchi degli steroli
  
  Se c è maggiore del 5% significa che c'è stata un'aggiunta di olio di sansa.
  
   
• Metodo basato sul rapporto degli alcooli superiori
  Introduzione
  Quando si allontanano le cere dall'olio di sansa, questo allontanamento avviene più efficacemente per le cere costituite da esteri di alcooli di peso elevato.
  Negli olî non decerati il rapporto tra un alcool C₂₆ (cerilico) ed uno C₂₄ (lignocerilico) è circa 1, mentre negli olî decerati, poichè l'alcool più lungo viene eliminato con resa più alta, il rapporto scende a 0.3 circa.
  Ciò permette di stabilire se un olio decerato è stato aggiunto ad uno naturale.
  Modus operandi
  • preparazione frazione insaponificabile
    10g di sostanza da analizzare vengono posti in una beuta con 100ml di KOH 2N in EtOH e portati ad ebollizione per un ora.
    Successivamente si raffredda fino a 30-35 ºC, si lava con acqua distillata ed etere etilico e si immette in un imbuto separatore.
    Si agita e poi si lascia riposare.
    Dopo separazione sulla fase acquosa si effettuano due ulteriori estrazioni con 50ml di etere etilico; si riuniscono gli estratti in un imbuto separatore e si lavano con 50 ml di acqua per due o tre volte.
  • purificazione frazione insaponificabile con cromatografia su colonna
    Dopo essicamento tramite Na₂SO₄ anidro si distilla l'etere fino ad ottenere un volume non superiore a 4 ml.
    Si prepara nel frattempo una colonna cromatografica impaccandola con una sospensione uniforme di allumina (10g) ed etere etilico (50ml).
    Successivamente si versano nella colonna la soluzione di etere contenente la frazione insaponificabile, e si lava il contenitore con qualche ml di etere etilico.
    Lavando la colonna con 200 ml di etere etilico otteniamo la frazione insaponificabile, mentre eventuali acidi grassi liberi rimangono adsorbiti nella colonna.
    Per distillazione (sotto vuoto per gli ultimi ml) si elimina l'etere.
  • separazione dei costituenti tramite cromatografia su strato sottile (TLC)
    Una lastra di vetro di 20x20 cm viene ricoperta da una sospensione omogenea di 40 g di silice in 80 g di acqua, alta 0.25 mm.
    Dopo che la lastra è asciutta (all'aria per un'ora ed in stufa a 120 ºC per due ore) la si può conservare in un apposito essicatore.
    Nel frattempo si prepara una soluzione al 5% della frazione insaponificabile in cloroformio.
    0.3 ml di codesta soluzione vengono strisciati con una microsiringa a 2 cm dal bordo della lastra cromatografica (linea di partenza).
    La corsa si ottiene in solvente esano : etere = 1: 1 fino a 1 cm dal bordo superiore della lastra.
    Una volta che l'analisi TLC si è completata si asciuga la lastra e la si bagna conl sale sodico di 2,7-diClfluorescina O.1% in EtOH (fluorescente nel giallo).
    Si otterrà una cromatografia di questo tipo:
    • fronte + carotenoidi
    • idrocarburi
    • tocoferoli
    • alcooli superiori e triterpenici
    • steroli
    • eritrodiolo e uvaolo
    • start
  • asportazione della banda degli alcooli superiori e degli alcooli triterpenici e loro silanizzazione
    la banda degli alcooli superiori e degli alcooli triterpenici viene asportata con una spatola e viene aggiunta di 6ml circa di etere etilico.
    Dopo circa 12 ore di riposo si filtra e in corrente d'azoto si evapora cautamente.
    Infine si essica in stufa a 100 ºC per 10 min. Poichè questi alcooli non sono adatti ad essere sottoposti direttamente ad una analisi cromatografica, è più opportuno trasformarli nei loro trimetilsilileteri (TMSE) facendoli reagire con 0.2 ml di metilformammide, 0.2 ml di esametildisilazano e 0.2 ml di trimetilclorosilano (a temperatura ambiente per mezz'ora).
  • gas-cromatografia dei silanizzati
    L'apparecchio usato è un gas-cromatografo ad alta risoluzione con fase fissa costituita da polimetilfenilsilossano (OV17) al 3% su supporto inerte di Chromosorb W 80-100 mesh, largo internamente 3.5 mm circa e lungo da 2 a 3 metri. Non esiste, data la variabilità delle colonne, un protocollo standard (per esempio si può operare con una camera d'iniezione a 280 ºC e con una colonna a 240 ºC).
  • identificazione e valutazione dei rapporti tra le aree dell'alcool cerilico e dell'alcool lignocerilico.
    Una volta ottenuti i picchi si confronta l'area relativa all'alcool cerilico e quella dell'alcool lignocerilico: valori C26/C24 < 0.9 rivelano la presenza di olio di sansa.
    Altri valori medî relativi al rapporto C26/C24 sono:
    Olio di pressione: 1.3
    Olî rettificati 1.12
    Olî di sansa normali 0.98
    Olî di sansa decerati 0.30

Dott. Francesco Meriani

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